磷酸三邻甲苯酯对鸡脑组织谷氨酸/谷氨酰胺循环及其关键酶表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.42.017

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (42): 6811-6816.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.42.017

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磷酸三邻甲苯酯对鸡脑组织谷氨酸/谷氨酰胺循环及其关键酶表达的影响

左恩俊¹，姜莹²，朴丰源³

1大连医科大学口腔医学院，辽宁省大连市 116044
2大连医科大学杂志社，辽宁省大连市 116044
3大连医科大学劳动卫生与环境卫生学教研室，辽宁省大连市 116044

修回日期:2014-09-16 出版日期:2014-10-08 发布日期:2014-10-08
通讯作者: 朴丰源，博士，教授，博士生导师，大连医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生教研室，辽宁省大连市 116044
作者简介:左恩俊，男，1981年生，黑龙江省鹤岗市人，汉族，2007年佳木斯大学毕业，硕士，主要从事基础医学方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81102160，30771819)

Effects of tri-ortho-cresyl phosphate on homeostasis of the glutamate-glutamine cycle and its key enzymes in the brains of hens

Zuo En-jun¹, Jiang Ying², Piao Feng-yuan³

1College of Stomatology, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China
2Press of Journal, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China
3Department of Occupational and Environmental Health, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China

Revised:2014-09-16 Online:2014-10-08 Published:2014-10-08
Contact: Piao Feng-yuan, M.D., Professor, Doctoral supervisor, Department of Occupational and Environmental Health, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China
About author:Zuo En-jun, Master, College of Stomatology, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81102160, 30771819

摘要/Abstract

摘要：

背景：有机磷化合物诱导的迟发性神经毒性发生的确切机制不清楚而尚无有效的治疗方法。
目的：观察磷酸三邻甲苯酯对鸡脑组织谷氨酸/谷氨酰胺循环及其关键酶表达的影响。
方法：成年罗曼母鸡24只随机分为3组，每组8只。①磷酸三邻甲苯酯染毒组剂量为1 000 mg/kg，经灌胃一次性给予实验鸡。②苯甲基磺酰氟干预组先将苯甲基磺酰氟按40 mg/kg剂量给鸡皮下注射，24 h后，再经灌胃一次性给鸡1 000 mg/kg的磷酸三邻甲苯酯。③对照组则给予等量安慰剂。每组于5 d和21 d时间点各处死4只鸡，迅速取脑于-80 ℃深冻冰箱保存。ELISA法检测谷氨酰胺合成酶和谷氨酰胺酶含量及谷氨酰胺合成酶活性，应用相应的试剂盒对细胞外谷氨酸和谷氨酰胺浓度进行测定，利用Fluo3-AM检测细胞内钙离子浓度。
结果与结论：磷酸三邻甲苯酯在暴露早期(5 d)可诱导鸡脑组织谷氨酰胺合成酶和谷氨酰胺含量及谷氨酰胺合成酶活性显著下降；谷氨酸和细胞内钙离子浓度显著升高。提示谷氨酰胺合成酶活性抑制所导致的谷氨酸/谷氨酰胺循环障碍和钙离子浓度显著升高可能与磷酸三邻甲苯酯暴露鸡诱发的迟发性神经毒性机制密切相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 迟发性神经病, 磷酸三邻甲苯酯, 苯甲基磺酰氟, 谷氨酰胺, 谷氨酸, 谷氨酰胺合成酶, 谷氨酰胺酶, 机制, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Although incidents of organophosphate-induced delayed neurotoxicity have been documented for over a century, the molecular mechanisms underlying the axonopathy remain poorly understood.
OBJECTIVE: To discuss the effects of tri-ortho-cresyl phosphate (TOCP) on homeostasis of the glutamate-glutamine cycle and the expression of key enzymes in the brains of hens.
METHODS: Twenty-four adult hens were randomly divided into three groups (n=8). TOCP group was treated with TOCP by gavage at a single dosage of 1 000 mg/kg, and control group was given an equivalent volume vehicle by gavage, while hens in the phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)+TOCP group were subcutaneously injected with 40 mg/kg PMSF followed by 1 000 mg/kg TOCP 24 hours later. The hens were killed on days 5 and 21 post-dosing. The brains were taken out quickly and preserved in a -80 ℃ deep freezer. ELISA was used to determination the content of glutamine synthetase and glutaminase and the activity of glutamine synthetase. Corresponding kits were used to measure the level of glutamate and glutamine. Fluo3-AM was used to measure cytosolic calcium concentration.
RESULTS AND CONCLUSION: The activity and content of glutamine synthetase and the concentration of glutamine were down-regulated, while the concentrations of the intracellular Ca²⁺ and glutamate were up-regulated in the early stage after TOCP administration. It is also suggested that the downregulated expression of glutamine synthetase may be associated with organophosphate-induced delayed neurotoxicity through the disruption of homeostasis of the glutamate-glutamine cycle and cytosolic calcium concentration.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: phosphoric acid esters, organophosphorus compounds, glutamine, glutamic acid

中图分类号:

R318

左恩俊，姜莹，朴丰源. 磷酸三邻甲苯酯对鸡脑组织谷氨酸/谷氨酰胺循环及其关键酶表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(42): 6811-6816.

Zuo En-jun, Jiang Ying, Piao Feng-yuan . Effects of tri-ortho-cresyl phosphate on homeostasis of the glutamate-glutamine cycle and its key enzymes in the brains of hens[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(42): 6811-6816.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 实验选用成年罗曼母鸡24只，实验过程无脱失，均进入结果分析。

2.2 TOCP暴露对鸡脑谷氨酰胺合成酶和谷氨酰胺酶含量的影响 TOCP染毒诱导OPIDN对鸡脑谷氨酰胺合成酶和谷氨酰胺酶含量的影响结果见图1A。TOCP染毒5 d时，TOCP组谷氨酰胺合成酶含量是对照组的0.76倍(P < 0.05)，是PMSF干预组的0.77倍(P < 0.05)。TOCP染毒 21 d时，TOCP组谷氨酰胺合成酶蛋白含量与对照组和PMSF干预组比较，无显著变化。TOCP染毒5 d和染毒21 d两个时间点，TOCP组谷氨酰胺酶含量与对照组和PMSF干预组比较，无显著变化(见图1B)。

2.3 鸡脑谷氨酰胺合成酶活性测定结果 TOCP染毒诱导OPIDN期间，鸡脑谷氨酰胺合成酶活性见图2。TOCP染毒5 d时，TOCP组脑谷氨酰胺合成酶活性是对照组的0.84倍(P < 0.05)，是PMSF干预组的0.825倍(P < 0.05)。TOCP染毒21 d时，TOCP组谷氨酰胺合成酶活性与对照组和PMSF干预组比较无显著变化。

2.4 TOCP暴露对鸡脑谷氨酸和谷氨酰胺浓度影响 TOCP染毒诱导OPIDN期间，鸡脑谷氨酸浓度见图3A。TOCP染毒5 d时，TOCP组谷氨酸浓度是对照组的 1.38倍(P < 0.05)，是PMSF干预组的1.28倍(P < 0.05)。TOCP染毒21 d时，TOCP组谷氨酸浓度与对照组和PMSF干预组相比较，无显著变化。TOCP染毒诱导OPIDN期间，鸡脑谷氨酰胺浓度见图3B。TOCP染毒5 d时，TOCP组谷氨酰胺浓度是对照组的0.84倍(P < 0.05)，是PMSF干预组的0.8倍(P < 0.05)。TOCP染毒21 d时，TOCP组谷氨酰胺浓度与对照组和PMSF干预组比较，无显著变化。
2.5 TOCP暴露对鸡脑细胞内钙离子浓度影响 TOCP染毒诱导OPIDN期间，鸡脑细胞内钙离子浓度测定结果见图4。TOCP染毒5 d时，TOCP组细胞内钙离子浓度是对照组的1.23倍(P < 0.05)，是PMSF干预组的1.12倍(P > 0.05)。TOCP染毒21 d时，TOCP组细胞内钙离子浓度与对照组和PMSF干预组相比较，无显著变化。

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引言

一些有机磷化合物如磷酸三邻甲苯酯(tri-ortho-cresyl- phosphate，TOCP)、PSP、DFP等可诱发人或敏感动物迟发性神经毒性(organophosphate-induced delayed neurotoxicity，OPIDN)^[1]，苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)可抑制或增强有机磷化合物引起的OPIDN的发生^[2-3]。100多年来，各国学者虽然对OPIDN进行了大量研究，但其诱发分子机制仍不十分清楚。el-Fawal等^[4]发现，PSP染毒鸡的坐骨神经内钙离子浓度与对照组相比显著升高；Choudhary等^[5]发现，敌敌畏诱导鸡OPIDN时，突触内钙离子浓度明显升高；Masoud等^[6]的实验也发现OPIDN的发生伴随神经细胞内钙离子浓度升高。另外，Qian等^[7]通过体外细胞实验发现，DFP染毒后细胞钙离子荧光强度在线粒体内与胞浆内比值明显降低，说明细胞内钙离子稳态发生改变。

同时国内外学者证实恢复细胞内钙离子稳态在改善OPIDN临床症状及病理变化上可以取得良好的效果^[8-10]，以上提示有机磷染毒后细胞内钙离子浓度升高与OPIDN的发生发展关系密切。实验证实OPIDN时期钙离子浓度的升高可以导致一些激酶如calpain和CaMKⅡ等被激活，被激活的激酶进一步降解细胞骨架或使细胞骨架及相关蛋白磷酸化增强，干扰了细胞骨架的动力学平衡，导致细胞骨架聚集于肿胀轴突内，引发轴突运输障碍并最终导致轴突神经退行性变发生^[11-12]。激酶激活导致细胞骨架稳态失衡被认为是钙离子浓度升高的后果之一，但是OPIDN时期，钙离子浓度升高的机制目前却不十分清楚。

谷氨酸是兴奋性神经递质，通过持续作用于谷氨酸受体，可以引起细胞内钙离子浓度的显著升高，最终引起细胞出现一系列严重后果^[13]，因此细胞外过量的谷氨酸也可以成为强大的诱发神经细胞功能紊乱的神经毒物。有研究发现神经元轴突结间不但表达离子型谷氨酸受体而且表达代谢型谷氨酸受体，过分刺激他们将引起钙离子内流及钙库的钙释放，最终引发轴突的退行性变^[14]。由于谷氨酸不能透过血脑屏障进入脑和脊髓内，在神经系统中，谷氨酸在突触间的含量通过谷氨酸/谷氨酰胺循环进行调控^[15]，神经突触释放的谷氨酸通过转运体进入星形胶质细胞内，之后在星形胶质细胞特有的谷氨酰胺合成酶催化下生成没有神经毒性的谷氨酰胺，并被释放出去，神经元细胞通过转运体将谷氨酰胺转运至细胞内，在线粒体内可以通过谷氨酰胺酶的作用重新生成谷氨酸，以上谷氨酸与谷氨酰胺在神经元和星形细胞之间的相互转换被称为谷氨酸/谷氨酰胺循环，谷氨酰胺合成酶和谷氨酰胺酶均是该循环中最为关键的酶之一^[16]。本组实验通过ELISA法在蛋白水平对谷氨酰胺合成酶和谷氨酰胺酶的含量和谷氨酰胺合成酶活性进行验证。随后，还对细胞外谷氨酸和谷氨酰胺浓度及细胞内钙离子浓度进行了测定，以期了解OPIDN时期，谷氨酰胺合成酶的表达是否影响其所调控的谷氨酸/谷氨酰胺代谢，并进一步影响细胞内钙离子浓度。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2013年4至12月在大连医科大学劳动卫生与环境卫生教研室实验室完成。

材料：

实验动物：成年罗曼母鸡，10月龄，体质量1.5-2.0 kg，购自大连韩伟养鸡场。

实验方法：

TOCP染毒诱发鸡OPIDN模型的制备：成年罗曼母鸡24只，经适应性喂养1周，确定没有任何步态异常后，随机分为3组，每组8只，分别为TOCP染毒组(TOCP组)，PMSF+TOCP组(PMSF干预组)和对照组。其中TOCP染毒组将TOCP溶于二甲基亚砜中，按1 000 mg/kg剂量经灌胃一次性给予实验鸡；PMSF干预组先将PMSF溶于二甲基亚砜中，后按40 mg/kg剂量给鸡皮下注射，24 h后再经灌胃一次性给鸡1 000 mg/kg的TOCP；而对照组则给予等量的生理盐水。各组动物饲以普通鸡饲料，饮用自来水，自由活动，饲养室每天照明12 h，温度20 ℃左右。每组于5 d和21 d时间点各断头处死4只鸡，迅速取脑于-80 ℃深冻冰箱保存待用。

谷氨酰胺合成酶和谷氨酰胺酶含量测定：取脑组织冰上剪切成细小的碎片。融解RIPA裂解液，于每组中按照每20 mg组织加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。并在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1 mmol/L。用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。充分裂解后，(10 000-14 000) ×g离心3-5 min，取上清，以上各步均在冰上进行。取0.8 mL蛋白标准配制液加入到BCA蛋白浓度测定试剂盒蛋白标准(20 mg BSA)管中，充分溶解后配制成25 g/L的蛋白标准溶液。取20 μL 25 g/L蛋白标准，加入980 μL稀释液进行稀释成最终浓度为0.5 g/L。BCA试剂A按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50∶1)，加 100 μL BCA试剂B，混匀，配制成5.1 mL BCA工作液。将标准品按0，1，2，4，8，12，16和20 μL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20 μL。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20 μL。各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置20-30 min。测定462 nm波长依序测量各孔吸光度(A值)，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

将各组样品蛋白质稀释成统一浓度。稀释标准品成不同浓度，谷氨酰胺合成酶分别是2，4，8，16，32 U/L；谷氨酰胺酶分别是1.25，2.5，5，10，20 U/L。分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂)、标准孔和待测样品孔。每孔50 μL，加入孔底部并轻摇混匀。封板膜封板后置37 ℃温育30 min。小心揭掉封板膜，弃去反应液，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s弃去，如此重复5次，拍干。每孔加入酶标试剂50 μL，空白除外。温育，洗涤。加显色剂A和B，轻轻震荡，避光显色10 min。每孔加终止液50 μL，终止反应。在加入终止液后15 min内进行，以空白调零，450 nm波长依序测量各孔吸光度(A值)。

谷氨酰胺合成酶活性测定：分别收集各实验组上清液(见谷氨酰胺合成酶和谷氨酰胺酶含量测定)50 μL，迅速加入谷氨酰胺合成酶检测试剂(具体操作参照谷氨酰胺合成酶试剂盒说明书)，550 nm下测定吸光度(A值)，计算谷氨酰胺合成酶活性。

谷氨酸与谷氨酰胺浓度测定^[17]：10%组织匀浆2 mL加0.6 mL试剂1混匀(组织匀浆与试剂1的体积比为1∶3)， 1 000×g，4 ℃离心10 min，取上清液0.5 mL待测。对于谷氨酸浓度测定，加入1 mL试剂2、0.1 mL试剂3、 0.01 mL试剂4混匀，37 ℃孵育40 min；对于谷氨酰胺浓度测定加入0.01 mL试剂2，37 ℃孵育15 min后，再加入1 mL试剂3、1 mL试剂4，37 ℃孵育15 min。蒸馏水调零，谷氨酸于 340 nm处测定吸光度(A值)，而谷氨酰胺于630 nm处测定吸光度(A值)。

细胞内钙离子浓度测定：参考Lajdova等^[18]的实验进行：1 mg Fluo 3-AM溶于442 µL无水二甲基亚砜里制备成2 mmol/L储备液。用HBSS稀释Fluo3-AM溶液，制备 5 µmol/L的Fluo3-AM工作液。向Fluo3-AM/二甲基亚砜溶液中加入pluronic F127，使其最终浓度为0.02%。将Fluo3-AM工作液加入事先收集好的神经元细胞中，避光 37 ℃培养35 min。离心去上清液，HBSS洗涤细胞3次。重新制备细胞悬液，细胞浓度为1×10⁸L^-¹。 37 ℃避光培养20 min，荧光分光光度计检测，激发波长488 nm，发射波长530 nm。

主要观察指标：鸡脑组织谷氨酰胺合成酶和谷氨酰胺酶含量及谷氨酰胺合成酶活性；鸡脑组织谷氨酸和谷氨酰胺浓度；鸡脑细胞内钙离子浓度。

统计学分析：使用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，采用单因素方差分析对不同组别数据进行比较，SNK-q检验进行组间两两比较，检验水准a=0.05。

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讨论

OPIDN是一种公认的后果严重的神经退行性病变，其以神经系统轴索Wallerian样变性及继发脱髓鞘为主要病理特征，病情严重的患者通常出现运动障碍、麻痹甚至瘫痪的症状，严重影响了患者的生活质量^[19]，因此该病得到了广泛的关注。然而，关于影响OPIDN发生发展的机制目前尚不十分清楚。

钙离子是神经系统维持各项生理活动不可缺少的离子，细胞内钙离子稳态失衡会触发例如细胞骨架破坏，蛋白质异常水解，线粒体功能紊乱及DNA损伤等等一系列非常严重后果^[20-21]，有学者发现神经组织细胞内钙离子浓度在OPIDN时期显著升高，同时本研究结果也显示，TOCP染毒早期细胞内钙离子浓度在TOCP组较对照组及PMSF干预组浓度显著升高，以上提示TOCP诱导细胞内钙离子浓度升高可能与OPIDN的发生发展有关。谷氨酸作为钙离子信号的主要调控者，通过作用于谷氨酸受体可以引起细胞去极化及细胞内钙离子浓度的增加，然而细胞外谷氨酸浓度持续升高会因为过分刺激谷氨酸受体而引起钙超载^[22-23]，由于神经系统谷氨酸的代谢主要受谷氨酸/谷氨酰胺循环控制，由此可推断调控谷氨酸/谷氨酰胺循环的关键酶表达失调将可能影响到谷氨酸水平及细胞内钙离子浓度。

Liu等^[24]发现氯化二甲基汞慢性染毒大鼠12周后，谷氨酰胺合成酶活性显著降低，谷氨酰胺酶活性显著升高，由此引起谷氨酸及细胞内钙离子水平显著升高。Yu等^[25]也发现在6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导帕金森震颤模型中，大鼠脑内谷氨酰胺合成酶表达下降引起谷氨酸浓度的显著升高。同时Castegna等^[26]在实验性变应性脑脊髓炎模型(EAE)中发现，谷氨酰胺合成酶酶活性的下降与谷氨酸/谷氨酰胺比值及钙离子浓度升高有关。

在本实验中，蛋白质双向电泳结合质谱分析鉴定出来的表达下调的蛋白质谷氨酰胺合成酶进一步在基因水平和蛋白质水平被验证，结果显示与本研究第二部分结果有很好的一致性。同时发现在TOCP染毒早期，TOCP组与对照组及PMSF干预组比较，谷氨酸水平显著升高，谷氨酰胺水平显著下降，此结果可能由于谷氨酰胺合成酶的表达下降所导致。然而，谷氨酸/谷氨酰胺循环中另一个关键酶谷氨酰胺酶，不论是在TOCP染毒早期还是在晚期，其表达均没有明显的改变，由此推测在OPIDN时期，可能是谷氨酰胺合成酶而不是谷氨酰胺酶在破坏谷氨酸/谷氨酰胺循环，提高谷氨酸水平中起到关键作用。

调控谷氨酰胺合成酶表达的机制已经被广泛的研究，一些研究报道发现在谷氨酰胺合成酶基因上游区包含一个糖皮质激素反应原件并可以与糖皮质激素受体蛋白结合，糖皮质激素通过刺激基因转录来调控谷氨酰胺合成酶表达^[27-28]。另外，有报道c-Jun可以通过抑制糖皮质激素受体转录而抑制谷氨酰胺合成酶表达^[29-30]。本课题组及其他学者都有报道在有机磷染毒之前或之后给予糖皮质激素可以有效的减轻OPIDN的临床症状及病理变化^[31-32]，而Damodaran等^[33]研究发现在DFP诱导OPIDN模型中，c-jun表达水平显著升高。然而OPIDN时期，TOCP诱导的谷氨酰胺合成酶表达降低的机制仍不清楚，是否与以上的研究结果有关还需进一步的实验探讨。

总之，通过ELISA进一步验证了活性降低的谷氨酰胺合成酶，同时也发现在TOCP染毒组的鸡脑中谷氨酸及细胞内钙离子水平显著升高，而谷氨酰胺水平显著下降。结果提示由于谷氨酰胺合成酶活性降低引起谷氨酸水平升高可能最终通过诱导细胞内钙离子浓度增加而影响OPIDN的发生发展。谷氨酰胺合成酶活性降低的原因及通过干预谷氨酰胺合成酶活性是否可以作为预防OPIDN发生的方法或治疗手段有待研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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磷酸三邻甲苯酯对鸡脑组织谷氨酸/谷氨酰胺循环及其关键酶表达的影响

Effects of tri-ortho-cresyl phosphate on homeostasis of the glutamate-glutamine cycle and its key enzymes in the brains of hens

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